|
|
Functional Characterization of SCFFBXO38 Ubiquitin Ligase-dependent Protein Degradation
Dibus, Nikol ; Čermák, Lukáš (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; D´Angiolella, Vincenzo (oponent)
Ubikvitin ligázy jsou zodpovědné za specifické rozpoznání proteinů určených k odstranění pomocí proteazomu. Cílem našeho projektu byla molekulární a funkční charakterizace ubikvitin ligázy SCFFBXO38 . Podobně jako u mnoha jiných není její biologická funkce dosud podrobně objasněna, přestože se jedná o jedinou ubikvitin ligázu, jejíž mutace vedou k rozvoji distální formy svalové atrofie. V první části našeho projektu jsme identifikovali nové substráty této ubikvitin ligázy, a to jaderné proteiny ZXDA a ZXDB, jejichž funkce není dosud popsána. Pomocí genetických a biochemických metod jsme prokázali, že proteiny ZXDA/B jsou pozitivními regulátory integrity centromerického chromatinu, a že experimentální inaktivace ubikvitin ligázy SCFFBXO38 vede ke stabilizaci proteinů CENP-A a CENP-B v oblasti centromer, a to v závislosti na ZXDA/B. Ve druhé části projektu jsme se zaměřili na analýzu myšího modelu s delecí genu Fbxo38. Prokázali jsme, že ztráta Fbxo38 vede k poruchám růstu, které postihují různé orgány včetně samčí reprodukční soustavy. Podrobnou histologickou analýzou jsme odhalili patologické změny v semenotvorných kanálcích doprovázené nižší produkcí spermií a sníženou fertilitou. Dále jsme ukázali, že FBXO38 je funkčně exprimována v Sertoliho buňkách, které jsou nezbytným regulátorem...
|
|
|
Novel substrates of cullin-RING ubiquitin ligases: identification and functional characterisation
Liďák, Tomáš ; Čermák, Lukáš (vedoucí práce) ; Grantz Šašková, Klára (oponent) ; Mašek, Jan (oponent)
Selektivní degradace proteinů ubikvitin-proteazomovým systémem je nezbytná pro udržování buněčné homeostázy a regulaci celé řady biologických procesů. Selektivita tohoto systému je dána stovkami ubikvitin ligáz, které specificky rozeznávají proteiny určené k degradaci (tzv. substráty) a katalyzují jejich ubikvitinaci, čímž je označují pro následnou degradaci. Největší skupinu ubikvitin ligáz tvoří vícepodjednotkové cullin-RING ubikvitin ligázy. Navzdory významnému pokroku v pochopení jejich molekulární architektury, sestavení a regulace zůstávají substráty a funkce většiny z nich neznámé. Tato práce se zabývá dvěma ubikvitin ligázami z podrodiny cullin-RING ubikvitin ligáz 4 (CRL4) - CRL4DCAF4 a CRL4DCAF12 . Za účelem identifikace jejich potenciálních substrátů a určení jejich biologických rolí bylo použito několik odlišných přístupů. S využitím proteomického přístupu jsme identifikovali širokou škálu potenciálních substrátů. Následně byla provedena podrobná charakterizace identifikovaných interakcí a testování podmínek, za kterých potenciální substráty podléhají degradaci. Nakonec byly za účelem odhalení fyziologické role CRL4DCAF4 a CRL4DCAF12 připraveny lidské buněčné linie a myší modely s vyřazeným genem pro DCAF4 a DCAF12. Zde prezentovaná identifikace a validace nových substrátů CRL4DCAF4 a...
|
|
|
Dynamika degradace hodinového proteinu PER2 pomocí detekce bioluminiscence v reálném čase ve tkáňovém explantátu cirkadiánních hodin mPER2Luc myši
Stanislavová, Faustýna ; Sumová, Alena (vedoucí práce) ; Doležel, David (oponent)
Hlavním oscilátorem cirkadiánních rytmů jsou suprachiasmatická jádra. Pomocí hodinových genů a jejich proteinových produktů (tvořících zpětnovazebné transkripčně- translační smyčky) představují významnou roli v řízení mnoha tělesných funkcích. Díky metodě využívající transgenní organismy byla měřena bioluminiscence, potažmo množství hodinového proteinu PER2. V této práci byl využit cykloheximid k inhibici proteosyntézy a k následnému sledování degradace tohoto hodinového proteinu v reálném čase. Protein byl měřen v explantátech suprachiasmatických jader dospělých myší, v suprachiasmatických jádrech fétů a v placentách. Dále byly porovnávány vlivy inhibitorů glykogensyntasykinasy 3b na dynamiku degradace proteinu PER2. Využit byl selektivní inhibitor CHIR-99021 a nespecifický inhibitor chlorid lithný. Z experimentu vyplývá, že inhibitor CHIR degradaci proteinu zpomaluje, a to ve všech použitých tkáních. Oproti tomu vliv nespecifického inhibitoru chloridu lithného nebyl jednoznačně určen. U fetálních jader byl jeho vliv na dynamiku degradace zpomalující, zatímco u dospělých jader byla degradace výrazně zrychlována. U explantátů placent nebyly pozorovány signifikantní výsledky. Výzkumy, zaměřující se na ovlivnění těchto hodinových genů, resp. jejich proteinů, by v budoucnu mohly být využity k...
|
|
|
Protein quality control in the secretory pathway of eukaryotic cells
Bařinková, Markéta ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Více než 30 % buněčného proteomu vstupuje během biogeneze do sekreční dráhy v eukaryotických buňkách. Sekreční dráha pak zajišťuje, že jsou tyto proteiny správně složeny, projdou nutnými posttranslačními úpravami a jsou dopraveny ke svému cílovému umístění ať už v membránových organelách, nebo vně buňky. Protože ale značné množství proteinů vstupujících do této dráhy je nefunkční, nebo se nefunkční stane, musí buňka disponovat mechanismy pro kontrolu kvality proteinů, pomocí kterých je z buňky odstraňuje. Jak proteiny putují sekreční dráhou, mohou být degradovány několika způsoby jak v endoplasmatickém retikulu, tak v Golgiho aparátu, endosomech nebo na plasmatické membráně. V těchto drahách je využíváno mnoho molekul od chaperonů, přes ubikvitin ligázy a mnoho dalších. Jsou spojeny sjednocujícím principem, který se nazývá "unfolded protein response" (reakce na nesložené proteiny). Ten tyto dráhy podporuje, pokud jsou přehlcené. Studium mechanismů kontroly kvality proteinů je nutností, neboť nám pomáhá osvětlit vznik značného množství buněčného proteomu. Poruchy v této dráze jsou navíc spojeny s řadou lidských onemocnění od cystické fibrózy po některé neurodegenerativní poruchy. Tyto degradační dráhy jsou zkoumány již několik desetiletí, ale díky posunům v technologii se stále vynořují nové...
|
host ::
RSS.